電気泳動
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還元アルキル化した Ovalbumin (OVA) 2 pmol を SDS-PAGE に供した。その後、
CBB にて染色を行った。
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ゲル内消化
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OVA 2 pmol/レーン を切り出し、In gel digestion 法 (参照 ： 通常感度内部配列決定）
に基づきトリプシンを用いて酵素消化を行った。
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質量分析
(nano ESI-MS 分析)
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消化溶液の半量 (1 pmol 相当) を ZipTip C18 （Millipore） 処理後、nanoESI-MS
分析を行った。
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データベース検索
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Mascot を用いて、OVA 配列に対して検索を行った。
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質量分析
(nano ESI-MS/MS 分析)
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残りの半量 (1 pmol 相当)を ZipTip 処理後、リン酸化としてヒットしたシグナルについて、nano
ESI-MS/MS 分析を行い、リン酸化部位の同定を行った。 |
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| *** MS 分析条件 *** |
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質量分析装置
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： Q-Tof2 (Micromass, UK) |
イオン化方式
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： Nanoflow ESI |
イオン化モード
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： Positive mode |
| MS 分析範囲 |
： m/z 250-4000 |
| MS/MS 分析範囲 |
： m/z 20-2700 |
2. 分析結果
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a) nano ESI-MS 分析
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MSMS 分析の結果、得られた多価イオン （Raw Data） を MaxEnt 3 処理によりすべて
1 価のモノアイソトピックイオン （[M+H]+） に変換し （MaxEnt 3 Data）、その質量から Mascot を用いて、OVA 配列に対してリン酸化ペプチドを検索した（ヒットしたリン酸化ペプチドは緑線で示す）。
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Mascot Search の結果、25 ペプチドがヒットした（カバー率 63%）。
変換前の多価イオン （Raw Data） を確認した結果、有意なシグナルで以下のリン酸化ペプチド（緑印）が検出された。
MS スペクトル （Raw Data）
(1) ペプチド 341-360 (m/z 2089.01 (1+), Phospho(STY))
(多価イオン実測質量： m/z 1044.99 (2+))
(2) ペプチド 63-85 (m/z 2525.25 (1+), Phospho(STY); Propionamide(C))
(多価イオン実測質量： m/z 842.43 (3+))
(2') ペプチド 60-85 (m/z 2915.49 (1+), Phospho(STY); Propionamide(C))
(多価イオン実測質量： m/z 729.62 (4+), m/z 972.50 (3+))
b) nano ESI-MS/MS 分析
(1), (2) ペプチドについて、リン酸化部位を同定するために、相当する多価イオン m/z 1044.99 (2 価イオン) ならびに m/z 842.43 (3 価イオン) の nano ESI-MS/MS 分析を行った。
MS/MS 分析の結果、得られた多価イオン （Raw Data） を MaxEnt 3 処理によりすべて
1 価のモノアイソトピックイオン （[M+H]+） に変換し （MaxEnt 3 Data）、その質量から Mascot を用いて、OVA 配列に対してリン酸化部位の同定を試みた。
リン酸化を考慮した通常検索の結果、(1) ペプチド 341- 360 の Ions score は
95 で、(2) ペプチド 63- 85 の Ions score は 69 であった。リン酸化の Neutral
loss を考慮した検索の結果、(1) ペプチド 341- 360 の Ions score は 123 で、(2)
ペプチド 63- 85 の Ions score は 124 であった。以下に Neutral loss を考慮した条件にて検索した結果を示す。
(1) ペプチド 341 - 360
m/z 1044.99 (2 価イオン) |
(2) ペプチド 63 - 85
m/z 842.43 (3 価イオン) |
_11.jpg) |
Mascot Search の結果、各ペプチドにおいて、帰属された y, b イオンの一致度は高く、高スコア
（Ions score） でヒットした。
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3. 結論
nano ESI-MS 分析
PMF (Peptide Mass Fingerprinting) 解析の結果、25 ペプチドがヒットした。そのうち、ヒットした
3 個のリン酸化ペプチドが Raw Data にて有意なシグナルとして検出された。
※ 解析結果の詳細は、以下の PDF ファイルをご覧下さい。
1. Mascot Search Results (PDF File)
2. Protein View (PDF File)
nano ESI-MS/MS 分析
リン酸化部位を示すプロダクトイオン (主に y, b イオン) が強く検出され、(1)
ペプチド 341-360 (m/z 1044.99 (2 価イオン)) は Ser345, (2) ペプチド 63-85
(m/z 842.43 (3 価イオン)) は Ser69 がリン酸化部位として同定された。
※ 解析結果の詳細は、以下の PDF ファイルをご覧下さい。
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(1) ペプチド 341-360
1. Mascot Search Results (PDF File)
2. Protein View (PDF File)
3. Peptide View (PDF File)
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(2) ペプチド 63-85
1. Mascot Search Results (PDF File)
2. Protein View (PDF File)
3. Peptide View (PDF File)
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