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セミドライのブロッターを使用してPVDF膜に転写し、CBBで染色するまでの方法を以下に示します。なお、ここでは、トリス-6-アミノ-n-カプロン酸溶液を使用した方法をご紹介いたしますが、トリス-グリシン緩衝液を使用した方法でも、転写後の膜を充分に洗浄すれば、プロテインシークエンサーで分析可能です。 |
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1. 試薬・材料 |
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溶液A ： |
0.3M Tris, 20% MeOH, 0.02% SDS (pHは約9.5となる) |
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溶液B ： |
25mM Tris, 20% MeOH, 0.02% SDS (pHは約9.3となる) |
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溶液C ： |
25mM Tris, 20% MeOH, 0.02% SDS, 40mM 6-アミノ-n-カプロン酸 (pHは約9.5となる) |
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PVDF膜 ： |
日本ポール, NEN, Bio-Rad, ABI, S&S, ミリポアなどのPVDF膜 (GE ヘルスケアバイオサイエンス（株）
の Hybond P は使用できません) |
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濾紙 ： |
ゲルと同サイズに切ったもの（6枚） |
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ブロッター ： |
セミドライブロッター |
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CBB染色液 ： |
0.1% CBB-R250, 45% MeOH, 10% 酢酸 |
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脱色液(1) ： |
45% MeOH, 7% 酢酸 |
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脱色液(2) ： |
90% MeOH, 7% 酢酸 |
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超純水 ： |
ミリQ水 |
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2. 実験方法 |
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(1). |
サンプルを SDS-PAGE により分離する。
この際、陰極側の電極液に 1mM チオグリコール酸ナトリウムをフリーラジカルのスカベンジャーとして加える。 |
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(2). |
PVDF膜を活性化するために、MeOH (HPLC用) に 5秒浸し、ミリQ水で軽くすすぐ（これらはサンプルの泳動中に行う）。 |
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(3). |
PVDF膜は 溶液C 中にて、濾紙は 2枚ずつ 溶液A,B,C 中にてそれぞれ 15分間振とうする（これらはサンプルの泳動中に行う）。 |
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(4). |
溶液C に浸した濾紙、泳動後のゲル、PVDF膜、溶液B に浸した濾紙、溶液A に浸した濾紙の順にブロッターにセットする（濾紙は各2枚ずつ）。 |
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(5). |
パワーサプライに接続して、ブロッティングを開始する。
電流値はゲルのサイズやサンプルの分子量を考慮して決定する。
＜例＞
ミニゲル(1枚)の場合 = 200mA (3mA/cm2) 定電流にて 1時間の転写 (サンプルが
高分子量のものは転写時間をさらに延長させる)
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(6). |
転写後のPVDF膜は、ミリQ水で軽くすすいだ後、CBB染色液 で 5分間染色する。 |
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(7). |
脱色液(1) で 15分間振とうした後、ミリQ水で3回洗う。 |
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(8). |
最後に、脱色液(2) で40秒間振とうした後、膜を乾燥させる。 |
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こうして調製した PVDF膜から目的のバンドを切り出して、弊社までお送り下さい。12ウェルのミニゲル(約
9×7 cm) で電気泳動した場合、高感度シークエンサー ( 0.2 pmol 以上) で一度に分析できるのは
3レーン分程度、通常感度のシークエンサー ( 2 pmol 以上) では 10レーン分程度までとなります。 |
